1. DNA purification

금일 포스팅 할 생명과학실험의 실험 주제는 바로 "DNA purification" 입니다.

본 실험은 일반적인 DNA와 달리 supercoiled 형태를 가진 plasmid를 관찰하는것이 주 된 목표입니다.

그렇다면 왜? plasmid를 관찰하는 것일까요? 바로 plasmid는 벡터로 사용될 수 있고, 단백질을 발현하는 기능이 있기에 유전자 치료를 목적으로 사용될 수 있기 때문입니다. plasmid는 세균에서 분리하여 조작하기 쉽고, 세포 내로 쉽게 들어갈 수 있는 특징이 있기에 유전 재조합 기술에 사용됩니다.

 

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Plasmid_(english).svg#/media/파일:Plasmid_(english).svg

 

간단한 실험 순서를 소개하도록 하겠습니다. 

 a. Bacteria cell들을 EP tube에 Pellet으로 만들고, P1 buffer 250μl를 넣고 resuspension 시켜줍니다. 

    ( ㄴ resuspension 과정으로 플라스틱 랙에 Bacteria cell의 Pellet이 들어있는 EP tube를 5~6회 강하게 긁어 충격을 주어서 물리적인 방법으로 세포벽 파괴를 진행하였습니다.)

   ( P1 buffer = P1은 Resuspension buffer로써 cell membrane을 파괴할 수 있도록 도와주는 역할을 합니다. 그 구성 성분인 glucose는 cell wall이 깨지지 않도록 하여 삼투압을 유지해주는 역할, Tris는 pH를 buffering하여 일정하게 유지해주는 역할 (pH 8.0), EDTA는 세포벽을 단단하게 해주는 divalent ion을 떼어주는, 즉 세포벽의 구조를 유지시키는 마그네슘과 같이 2가 양이온을 제거하는 역할을 합니다.)

 b. resuspension된 EP tube에 250μl P2 buffer를 넣고 5~6번 inverting 진행해줍니다.

   (P2 buffer = P2는 Lysis buffer로써의 역할을 합니다. 그 구성 성분인 NaOH는 세포벽을 약하게 해주며 Chromosomal DNA를 변성 시켜주는 역할을 하고, SDS는 세포막을 해체하고 단백질을 풀어주는 Detergent의 역할을 합니다.)

 c. 350μl P3 buffer를 넣고 5~6번 inverting 후 ice에서 5분간 icing 해줍니다.      

(ㄴ icing 과정으로 SDS가 더욱 잘 엉기면서, 세포 불순물 및 Chromosomal DNA가 함께 엉겨 붙어 상대적으로 더 정확한 plasmid DNA 관찰에 도움을 줍니다.) 

  ( P3 buffer = P3는 Neutralization buffer로써 pH를 중화시켜주는 역할을 합니다. 그 구성 성분인 Potassium acetate는 P2 buffer로부터 높아진 pH를 중화시켜주는 역할을 하고, glacial acetic acid는 NaOH를 중화시켜 SDS를 불용성으로 만드는 역할을 합니다.) 

d. 12000rpm centrifuge에서 10분간 centrifugation을 진행해줍니다. 

e. 새 colume에 상층액 600μl만 따서 넣고 1분간 centrifugation을 진행해줍니다. 

f. 600μl Wash buffer를 넣고 1분간 centrifugation을 진행해줍니다. 

g. 걸러진 용액은 버리고 다시 한번 더 1분간 centrifugation을 진행해준 뒤, column을 새 EP tube에 담고, 20μl의 D.W.를 column 정중앙에 넣습니다. 

h. 1분간 centrifugation 후 EtBr 20μl 첨가 후 전기 영동판에 loading 한 뒤 Gel-doc을 이용하여 결과를 확인합니다.   

 (ㄴ 본 실험에서의 전기 영동판으로는 전기 영동 시 DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동하는 특징이 있는 Agarose gel을 사용하였습니다.)

 

 

실제 실험으로 나온 결과값. 맨 오른쪽 하얀색으로 보이는 바 모양이 DNA이다.

(위의 사진은 전기영동 진행 후 결과값을 촬영한 사진입니다. DNA에 결합한 EtBr이 UV에 노출되어 하얀색으로 발광이 되는 모습을 확인 할 수 있습니다)

위의 사진에서 흐리지만 3개의 하얀색 바를 확인 할 수 있는데, 이는 아래에서부터 supercoiled 형태의 plasmid, linear 형태의 DNA, open circular 형태의 DNA 순으로 확인됩니다. 이는 전기 영동 시 DNA 형태에 따른 agarose gel에서의 이동속도가 다르기 때문에 분리되어 보이는 것입니다. 또한 밴드가 아래에서부터 위로 갈수록 점점 옅어지는데 이는 EtBr이 DNA 분자량에 비례하여 결합하기에 plasmid를 보여주는 밴드가 가장 진하게 보여진다고 볼 수 있습니다.

 

아쉽지만 본 실험에서는 전기영동 결과값 확인이 제대로 되지 않았고, 이는 2가지의 원인을 생각해 볼 수 있을것 같습니다.

첫 번째로는 실험 도중 불순물이 제대로 정제되지 않은 DNA를 전기영동판에 loading하거나 20μl의 D.W.와 Mixing이 잘 되지 않아서 결과의 확인이 어려운 경우가 발생되었다고 추측할수 있습니다.

두 번째로는 Agarose gel의 sample well에 loading을 하는 과정에서 정상적인 loading이 일어나지 않아서 결과값을 확인 하기 어려운 경우가 있을 것입니다.

 

세포로부터 DNA를 추출하고자 할 때, 진행하는 과정을 크게 3가지로 나누어서 볼 수 있습니다. 

첫 번째는 세포의 수확 과정(Cell Harvest), 두 번째는 세포의 파괴 과정(Cell Lysis), 마지막으로 DNA purification 과정이 바로 그것입니다.

세포의 수확 과정에서는 원심분리기를 이용하여 수확 할 수 있고, 세포의 파괴 과정에서는 세포벽 및 세포막을 분해, 즉 세포를 용해시켜서 세포 내 DNA를 세포 밖으로 유출시키는 과정입니다. 이때 세포벽, 세포막을 분해 시키는 방법으로는 본 실험에서처럼 충격을 가해 물리적으로 파괴하는 방법과 Lysozyme이나 EDTA 처럼 화학적으로 파괴를 하는 방법이 있습니다. 세포막의 경우 SDS 등의 계면활성제를 사용하여 분해가 가능합니다. 마지막 단계인 DNA purification 단계에서는 앞선 과정으로 세포 외부로 나온 세포 추출물은 DNA 뿐만 아니라 단백질, RNA 등 이 포함되어 있기에 순수한 DNA만을 추출하고 정제하는 과정이라고 할 수 있습니다. 이 과정에서는 Phenol / Phenol-Chloroform을 첨가하고 원심 분리하여 단백질은 침전 시키고 상층의 핵산 만을 얻는 단백질 제거 과정, 에탄올 등을 이용하여 DNA의 용해도를 낮추고 원심 분리하여 DNA를 얻을 수 있는 RNA 제거 과정 등이 있습니다.

 

마지막으로 본 실험에 사용한 Silica를 이용한 DNA 결합 원리를 살펴보자면, Positive charge의 silica에 정전기적 인력에 의하여 Negative charge의 DNA가 결합하게 된다고 설명할 수 있습니다. 적절한 농도의 염(Na+)과 buffer를 DNA에 넣고 column을 통과시키면 silica로 구성된 막에 염이 결합하고 염과 DNA가 결합이 이루어집니다. 이때 불순물들은 아래로 침전되기에 순수한 DNA만 추출하는 것이 가능한 것입니다. 결합된 DNA는 에탄올 Washing 과정을 진행하여 Elution이 가능하고 그 결과로 순수한 DNA 만을 정제할 수 있는 것입니다.

 

 

Reference : 전기영동의 원리와 실험 (principles and Practice of Agarose Gel Electrophoresis) / KOREA SCIENTIFICS / P.2~5

분자생물학 제 5판 / Robert F. Weaver / 라이프 사이언스 / P. 7~8, 72~74

Plasmid DNA의 분리 / 네이버 블로그 플라스미드(Plasmid) DNA 분리 - 원리(Principle)와 방법(Methods) : 네이버 블로그 (naver.com)를 참고 하였습니다.