2. Real Time PCR

 금일 포스팅 할 주제는 바로 "Real Time PCR"입니다.

 

 Real Time PCR을 한글로 나타내자면 실시간 중합효소연쇄반응입니다. 이름에서 알 수 있듯이 중합효소 연쇄 반응을 기반으로 한 실험인데, 우리가 원하는 Target의 DNA 분자의 증폭과 양의 측정을 동시에 할 수 있기에 "실시간"이라는 단어가 앞에 붙게 되었습니다.

 

 금일 포스팅의 실험에서는 Real Time PCR에 대해서 공부해 보고 이를 통하여 돼지의 발정주기와 임신상태에 따른 유전자 발현을 SYBR Green Method를 통하여 형광의 세기를 통해 측정하고 측정된 값을 이용하여 유전자 발현을 파악해 보는 것이 실험의 목표입니다.

 

 실험의 순서는 아래와 같습니다. 

a. 미리 준비된 cDNA를 2μl의 양으로 micropipette을 이용하여 EP tube에 넣어줍니다. 

  (ㄴ 본 실험에서는 Reference gene으로 RPL7을 사용하였습니다.)

b. ddH20를 4μl 넣고, Forward, Reverse Primer를 2μl씩 넣어줍니다.c. SYBR Green Master Mix 10μl를 넣어주어 Total volume을 20μl로 만든 뒤, qRT-PCR machine에 넣어서 분석합니다.d. Step one software를 이용해 dCt 및 ddCt값을 구한 뒤, 이를 통하여 (ddct method 사용) Data analysis를 합니다.

 

 실험은 위에 기재한 것이 전부입니다. 간단하고 금방 끝나는 실험이지만 그 결과 분석은 그렇지 못합니다...ㅜㅜ

우선 결과값을 보기 전에 알아둬야 할 몇 가지 개념을 정리하고 결과를 정리하도록 하겠습니다.

첫 번째는 바로 앞으로 결과에 나올 Ct값의 개념입니다.

Ct(Threshold cycle) 값은 threshold와 접점을 나타내는 형광신호의 cycle 수를 의미합니다. Template의 양을 측정하는데 이용됩니다.

Ct값 / Target의 Standard curve와 Threshold가 만나는 지점이 Ct 값이다.

또한 이렇게 Standard curve에서 얻은 농도별 Ct 값을 바탕으로 검량선을 그릴 수 있습니다. (Log 그래프로 표현)

 

기울기 = -3.32 / R^2 = 0.999인 검량선의 그래프.

R^2(Correlation coefficient) 값은 검량선의 직선이 얼마나 잘 이뤄졌는지를 나타내며, 그 값이 1에 가까울수록 이상적인 값을 의미합니다.

자 여기까지 간단한 용어 정리를 해보았습니다. 이제 본 실험에서 실제 결과를 바탕으로 데이터 분석을 해보도록 하겠습니다.

(※실험의 재료로 사용된 Template DNA으로는 발정주기 12일(D12C)과 임신 12일(D12P)의 돼지 자궁내막에서 추출한 RNA를 역전사 한 cDNA를 사용하였습니다.)

 

qRT-PCR machine으로 나온 실험의 Ct값.

 본 실험의 결과 Target gene에서의 12C 2 값이 측정되지 않아 12C 1 값으로 계산을 해보자면, dCt(C) = 30-14.4 = 15.6 , dCt(E) = 24.81-12.99 = 11.82 , ddCt = 11.82-15.6 = -3.78이므로 실제 발현량의 차이는 2^(-ddCt값) = 2^(3.78) = 13.74배 증가하였다는 것을 확인할 수 있다.

(본 실험에서의 Target gene에서는 D12C 2 값이 undeterminated 됨을 확인할 수 있습니다. 이는 Tube 내 PCR을 위한 kits들이 contaminated 되었음을 추측해 보거나, 실험 미숙의 다른 이유를 생각해 볼 수도 있을 것 같습니다. Pipette 내 이물질을 확인 안 하고 미확인 이물질이 실험 결과값 도출을 방해하는 요인으로 작용되었을 가능성도 있습니다...)

 마지막으로 실험과 관련된 내용들을 몇 가지 정리해 보고 금일 포스팅을 마치도록 하겠습니다.

우선 본 실험에서 진행된 Real Time PCR의 원리입니다. 이번 실험에서는 연쇄반응에 의해 증폭되는 DNA가닥에 형광물질 또는 서열 특이적인 탐침인자(Probe)가 결합하고 이로부터 발생하는 형광의 세기를 qRT-PCR machine의 감광센서로 감지하는 것으로 진행하였습니다.

추가적으로 본 실험에서 사용된 염색약은 SYBR Green 염색약인데, 이는 Double strand DNA에 결합한 형광물질이 발산하는 형광의 세기를 측정할 수 있도록 이중가닥에 붙어서 형광을 표지 하는 염색약입니다. = DNA binging dye (허나 SYBR Green은 이중가닥이면 무조건 결합하는 특징이 있기에, Sensitivity, Specificity는 낮은 편입니다.)

 다음으로는 ddCt Data analysis method에 대하여 간단하게 알아보겠습니다. 이 통계 방법은 Kenneth J. Livak 외 1명에 의해 거론된 실험법으로 DNA 복제에 대하여 발현 빈도를 상대적으로 비교 분석할 수 있는 통계 방법입니다. 그 식은 쉽게 2^(-ddCt)가 되며, 이를 통하여 Housekeeping gene과 비교되어 발현된 유전자의 상대적인 양을 알 수 있습니다.

ddCt method는 Sample의 Ct 값을 구한 뒤, Target과 housekeeping 간의 Ct 값 차이를 이용하여 dCt를 구합니다. 이후 발현량의 차이를 확인하기 위하여 dCt(E)-dCt(C)를 하여 확인해 줍니다. Ct값의 차이는 결국 cycle수의 차이라고 할 수 있는데, cycle수만 보고는 두 gene의 양을 정확하게 비교하기 어렵다 보니 양적인 차이로 표현하기 위하여 PCR 1 cycle인 2배 차이로 하여 2의 n배수로 표현을 하게 되는 것입니다.

 

Reference: Analysis of Relative gene expression data using Real-time Quantative PCR and 2^(-ddCt) Method / Kenneth J Livak 외 1명 / IDEAL / 2001 / p. 402~408

생화학 7판 / 레닌 / 월드사이언스 / 2014 / p.327

Spatial & Temporal patterns of Lysophospholipid acid receptor 3 expression in the Uterus during the eslious cycle and pregnancy in pig / 서희원/ Yonsei univ / 2007